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正确使用APOE检测试剂盒直接决定结果的可靠性

发布时间： 2025-12-16　　点击次数： 7次

　　熔解曲线法是实时荧光定量PCR中用于特异性验证与多重检测的关键技术，广泛应用于病原体鉴定、基因分型、SNP分析及假阳性排除。APOE检测试剂盒原理是通过监测PCR产物在升温过程中双链DNA解链时荧光信号的骤降，获得特征性熔解温度（Tm值），从而判断扩增产物的特异性与均一性。APOE检测试剂盒作为该技术的核心载体，其正确使用直接决定结果可靠性。

　　一、实验前准备
　　严格分区操作：试剂配制区、样本处理区、扩增区物理隔离，防止交叉污染；
　　试剂平衡与离心：使用前将冻干或冷冻试剂于室温平衡15分钟，并瞬时离心收集管壁液体；
　　按说明书配制反应体系：通常包含MasterMix（含DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、饱和染料如SYTO9或EvaGreen）、引物、模板DNA及无核酸酶水，避免反复冻融。
　　二、加样与上机
　　使用低吸附枪头，精确移取各组分，尤其引物与模板体积（常为1–5μL）；
　　每样本设复孔（至少2–3个重复），提高数据可信度；
　　覆盖矿物油或使用密封膜（若仪器要求），防止蒸发导致浓度变化；
　　避光操作：部分饱和染料对光敏感，全程避免强光直射。
　　三、程序设置
　　标准熔解曲线程序包括：
　　扩增阶段：95℃预变性→40个循环（95℃变性+退火/延伸）；
　　熔解阶段：95℃变性→65℃退火→缓慢升温至95℃（0.1–0.5℃/秒），同步采集荧光信号。
　　确保升温速率一致：不同速率会导致Tm值偏移；
　　选择合适荧光通道：与所用染料激发/发射波长匹配（如FAM通道用于SYBRGreenI）。
　　四、结果判读
　　单一尖锐峰：表明扩增产物特异、均一；
　　多峰或宽峰：提示引物二聚体、非特异扩增或污染，需优化引物或重新提取模板；
　　Tm值比对：与阳性对照或理论值偏差＞1℃时，应视为异常。
　　五、质控与记录
　　每次实验必须包含：阴性对照（无模板）、阳性对照和空白对照；
　　记录试剂批号、仪器型号、程序参数及原始熔解曲线图，满足GLP/GMP可追溯要求。

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