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正确使用是确保端粒酶活性检测试剂盒实验结果准确性的关键

发布时间： 2025-10-20　　点击次数： 126次

　　端粒酶活性是细胞增殖潜能与衰老状态的重要标志，在癌症研究、干细胞生物学及抗衰老领域具有关键意义。端粒酶活性检测试剂盒通过扩增端粒酶延伸的产物，实现对酶活性的高灵敏度检测。为确保端粒酶活性检测试剂盒实验结果的准确性与可重复性，掌握科学、规范的使用方法至关重要。

　　第一步：实验前准备与环境控制
　　在洁净、无核酸污染的实验室进行操作，避免外源DNA或RNase污染。使用专用移液器、枪头与离心管，建议使用带滤芯的吸头。提前将试剂盒各组分从-20℃冰箱取出，冰上融化后轻柔混匀，避免剧烈震荡。所有试剂使用后立即放回低温保存。
　　第二步：样本制备与处理
　　收集待测细胞（如肿瘤细胞、干细胞），用预冷PBS洗涤2-3次。采用裂解缓冲液（通常含CHAPS、DTT等）冰上裂解细胞15-30分钟，期间轻摇数次。4℃下12,000×g离心20分钟，取上清即为端粒酶提取物。蛋白浓度建议调整至0.1-2μg/μL，分装后-80℃保存，避免反复冻融。
　　第三步：反应体系配制
　　按说明书比例配制PCR反应混合液，通常包括：
　　端粒酶引物（TS引物）
　　扩增引物（CX引物）
　　dNTPs
　　Taq DNA聚合酶
　　缓冲液
　　在冰上操作，逐项加入，轻柔混匀，短暂离心去除气泡。建议设置三类对照：
　　阳性对照：试剂盒提供的端粒酶阳性提取物
　　阴性对照：热灭活样本（85℃加热10分钟）
　　空白对照：以裂解液代替样本
　　第四步：端粒酶延伸与PCR扩增
　　取适量样本提取物加入反应体系，先进行延伸反应（30℃孵育30分钟），使端粒酶在TS引物上添加TTAGGG重复序列。随后进行PCR扩增（94℃变性2分钟；94℃ 30秒，50-60℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环25-35次；72℃终延伸5分钟）。
　　第五步：产物检测与分析
　　扩增完成后，取10-15μL产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或琼脂糖凝胶电泳。银染或EB染色后观察梯状条带——每相差6bp形成一条带，表明端粒酶活性存在。也可使用荧光定量法（qTRAP）进行定量分析，绘制标准曲线计算相对活性。
　　第六步：数据记录与结果判读
　　记录样本来源、蛋白浓度、循环数及电泳结果。阳性对照应呈现清晰梯形条带，阴性对照无条带或极弱，空白对照无信号。样本条带强度可半定量反映端粒酶活性水平。

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