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第1部分:背景介绍
SNP全称Single Nucleotide Polymorphism,即单核苷酸多态,是指在基因组上单个核苷酸的变异,包括转换、颠换、缺失和插入,形成的遗传标记,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为2:1,转换的几率之所以高,可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点,其中大多数是甲基化的,可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。其数量很多,多态性丰富。一般而言,SNP是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。变异频率小于1%的变异为突变(mutation)。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×10E6 个。因此,SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。
在理想状态下,各等位基因的频率和等位基因的基因型频率在遗传中是稳定不变的,即保持着基因平衡。符合哈温平衡是检验SNP分型是否准确的标准。
SNP是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据,因此被广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因的研究。
第二部分:SNP的类型及应用
SNP类型:
内含子SNP(Intronic SNP)--不导致氨基酸的改变
调控区SNP(Regulatory region SNP)--影响蛋白表达量的调控
编码区SNP(Coding region SNP)--包括同义和非同义的,非同义的改变蛋白编码的序列
应用:
1、遗传图谱绘制的标记;
2、疾病诊断和疾病易感基因的鉴别;
3、药物基因组学研究和新药筛选;
4、药物代谢和药物遗传学;
5、法医鉴定和个体识别;
6、群体遗传学研究和遗传多态性分析;
7、物种鉴定、菌种鉴定等。
第三部分:技术路线
1.技术路线及其特点
Hi-SNP 分型服务
Hi-SNP 结合多重 PCR 技术和高通量测序技术,对需要检测的位点设计特异性引物,在单管内进行多重PCR 扩增,不同的样本以不同的 Barcode 引物区分。混合样本后,在 Ion Proton/illumina Hiseq/illumina X10平台上,对扩增子进行高通量测序。测序结果使用生物信息学方法,区分不同的样本,最终获得每个位点的SNP 信息。高通量测序能一次对几百万条 DNA 分子进行序列测定,相比其他的 SNP 检测技术,基于高通量测序的 SNP 分型具有更准确、更灵敏的特点。
2、分型流程及质控
流程:
a. 位点评估:物种,版本,位置信息→同源性评估
b. 引物设计及合成:根据扩增子设计引物
c. 样本抽提及质控:测浓度:20ng/uL,OD260/OD280:1.8-2.0;电泳:主带清晰无拖尾
d. 小试:多重PCR引物优化;PCR体系优化
e. 大规模生产建库:查漏补缺实验数据:出率95%以上
f. 测序
g. 数据分析,出具报告
SNP分型质控方案:
a. 信号单一
b. 阴性对照:实验室“分区",避免交叉污染;大规模实验的“节奏控制"
c. 重复对照:大规模实验时内部设置重复对照,由实验人员自身复核;做实验方案时的数据与大规模实验数据进行重复对照,由质控人员复核
d. HWE评估
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