大小鼠病原体检测时核酸提取过程中的问题和解决方案

一、PCR检测的应用

PCR（聚合酶链式反应）技术作为分子生物学领域的核心检测手段，广泛应用于微生物病原体检测、基因筛查和诊断、司法鉴定、遗传疾病的检测、药物代谢评估等多个领域。其原理是DNA片段扩增，根据特异性的引物扩增目的片段，通过片段大小或者结合探针实现目标核酸的检测，而这一过程的前提是获得高质量、高纯度的核酸模板。核酸提取作为PCR检测的前处理重要环节，其提取效果直接决定了PCR反应的成败、检测结果的准确性与可靠性。

二、核酸提取回收率对PCR反应特异性的影响

核酸提取过程中若残留杂质，会显著干扰PCR反应的特异性，甚至抑制扩增反应的进行。同样核酸提取效率对低丰度样本检测的影响。对于低丰度目标核酸样本（如早期感染阶段的病原体样本、微量组织样本、降解严重的DNA样本等），核酸提取效率直接影响了能否从样本中捕获到足够的目标核酸。若提取方法的回收率低，即使样本中存在目标核酸，也可能因提取过程中的损失导致获得的模板量低于PCR检测的低检出限，导致出现假阴性结果。

三、PCR检测在实验大小鼠微生物病毒病原菌检测领域的应用

常规样本的病毒检测方法，多采取血清学方法，血清学检测方法包括：酶联免疫吸附试验ELISA，免疫酶试验IEA，免疫荧光试验IFA等抗体检测方案。

病原菌的检测方案则多是培养法，有些需要进行生化反应进行鉴定。

国标GB14922－2022中规定了大小鼠的病毒、病原菌（细菌真菌）的检测项目，分为必须检测项目和必要时检测项目。

除此之外，随着分子生物学检测方法的进步，荧光定量PCR成为用于检测病毒感染的常用的方法。荧光定量PCR检测是通过检测荧光信号的强弱来判断是否存在病毒或病毒含量的高低。不同的荧光标记物也使得多重检测成为可能，比如一个反应体系内可见检测多重荧光FAM、HEX、ROX 荧光，每种荧光探针标记1-3种病毒，从而可以实现一个孔中多种病毒的检测。

荧光定量PCR检测病毒时所需的样本量少、更是可以在疾病早期检测到病毒感染，特异性高，也得到了广泛的应用和重视。翼和生物开发了多款qPCR检测试剂盒，可进行多种病原体的联检或者鉴定。分两种试剂盒，一种qPCR试剂盒是联检试剂盒，能判断样本是否感染国标规定的几种病毒或者病原菌，并且出现阳性的话可锁定在2-3种病原的范围，但是确定具体哪种病原感染则需要搭配鉴定试剂盒进行具体病原的鉴定。但是一般SPF来源的鼠样本都是比较干净，检测常为阴性，所以无需进行特定病原的鉴定。鉴定试剂盒中一个荧光通道只鉴定一种病原，所以可以通过荧光通道直接判断感染的具体病原。

四、核酸提取回收率对实验大小鼠病原微生物检测的影响

荧光定量PCR检测灵敏度高、特异性强，一般高于10 copies/μl的核酸病毒样本可被检测到。但是前提时核酸提取的流程正常。对于微量核酸的DNA、RNA提取流程如何保障样本的核酸提取质量呢？可以从几个角度进行：

1）购买来源正规的厂家核酸提取试剂盒产品。

2）提取过程中可以设置对照，比如标准菌株或者假病毒加入到样本中，看看核酸提取过程是否可以正常完成样本的提取，回收率是否正常。

3）提取过程中加入外源的其他物种的核酸，作为内参，质控提取过程。比如翼和生物的DNA/RNA提取试剂盒就含有外源基因组DNA作为内参，可以参与核酸的提取过程，质控提取过程，如果核酸提取过程正常，则PCR后所有样本都应该有人为加入的外源核酸的信号，并且这个信号不影响目标病原体的检测。

综上所述，核酸提取作为PCR检测的上游环节，其质量和回收效率直接影响PCR扩增的效率、特异性与灵敏度，是决定检测结果准确性、可靠性的重要因素。因此在实际检测中，需根据样本特性区分，选择合适的提取方法，以获得高质量的核酸模板，才能充分发挥PCR技术的高灵敏度、高特异性优势，为实验动物病原微生物的检测等领域提供可靠的检测数据。