甲基化检测技术

甲基化检测技术

一、甲基化检测

甲基化检测主要分为两大类，第一类非转化法，有甲基化特异限制性酶切法和免疫共沉淀法。第二类是转化法，有亚硫酸盐转化法和酶转化法。

1.甲基化特异限制性酶切法

利用甲基化敏感性内切酶（如HpaⅡ）无法切割甲基化CpG位点的特性，通过酶切片段大小判断甲基化状态。低成本，简便操作，适合快筛已知位点。局限：特定序列依赖，难辨部分甲基化，有假阳性风险，不适合混样。

2.免疫共沉淀法

用5-甲基胞嘧啶抗体富集甲基化DNA片段，结合测序（MeDIP-seq）分析。全基因组覆盖，无需预知甲基化位点，但分辨率低，抗体特异性要求高，对低甲基化区域不敏感。

3.亚硫酸盐转化法

亚硫酸盐处理使未甲基化C→U，多重PCR靶向富集目标区域，高通量测序定量单碱基甲基化水平。高灵敏度检测甲基化，质控严格，亚硫酸盐处理或致DNA降解需优化。

4.酶转化法

酶转化法通过特定的酶反应将甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，避免了亚硫酸盐处理的化学步骤，提供了一种更为直接和可能更精确的甲基化检测手段。优点是模板损伤少，甚至可区分出羟甲基胞嘧啶，但转化效率不全、有序列偏好性，样本需求量大，商业化试剂盒昂贵，流程不成熟。

二、转化后甲基化检测方法

转化后甲基化检测方法多样，例举几种常用方法。

1.焦磷酸测序测序峰图清晰，只需要低模板起始量，但有效读长只有60bp，无法获取周围CpG岛信息。

2.克隆测序确定CpG甲基化频率，500-800bp，每个位点需测序8-10次，但统计误差较大，重复性差（与克隆数有关），操作繁琐不宜大批量。

3.Hi-MethylSeq，翼和生物运用亚硫酸氢盐处理与多重PCR技术，实现目标区间甲基化位点的精确定量分析，一次测序反应每个位点测序长度在150-200bp，深度一般为一千倍以上。

4.qPCR法通过特定的引物探针或染料检测序列，实验流程快速便捷，定量准确，但针对固定的检测位点，覆盖范围有限，分辨率低，依赖引物/探针设计，通量受限。