RT-PCR方法--端粒酶活性检测

检测意义

1、临床上：观测是否有肿瘤。

2、工业客户：间接考察细胞是否有成瘤的可能性。

端粒酶活性检测的主要方案

1、直接检测端粒酶（蛋白及RNA的结合复合物）的活性，检测它是否可以延伸DNA模板，然后跑胶或者探针杂交，检测DNA延伸的长度，以此来判断端粒酶的活性高低。

该方法操作较复杂，灵敏度不高。

2、间接检测端粒酶（催化亚基的mRNA量）的活性。

该方法灵敏度高，操作相对简便。

YH端粒酶活性检测原理

双色荧光探针分别检测端粒酶催化亚基TERT基因mRNA和内参基因GAPDH mRNA。在进行样本检测时，同时检测阳性细胞293T和阴性MRC-5细胞做为对照，利用∆∆CT法计算样本中TERT基因的相对表达量。

检测所用主要仪器

荧光定量PCR： Real Time PCR System(ABI 7500，U.S.A)

RNA质控：Nanodrop 2000C Spectrophotometer(Thermo scientific，Germany）

检测所用试剂

RNA抽提试剂盒：RNAiso Plus kit(Code No.9108/9109，TaKaRa，Japan)

RNA逆转录试剂盒： RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(00820611，Thermo scientific，Germany)

双色荧光TERT基因检测试剂盒：上海翼和应用生物技术有限公司自研

阳性对照：293T细胞

阴性对照：MRC-5细胞（正常的人胚肺细胞）