目标区域甲基化重测序（Hi-MethylSeq）

第1部分：背景介绍

DNA 化学修饰为 DNA 序列编码基因的表达增加了一层调控机制。这些化学修饰中，研究得最透彻的是 5-甲基胞嘧啶 (5mC)，该修饰被通常认为是基因表达的一种稳定的抑制性调控因子。人类基因组含有大约 1% 的甲基化胞嘧啶，因此其是非常广泛的 DNA 修饰 。DNA甲基化(methylation)是一种表观遗传修饰，是在DNA甲基化转移酶(Dnmt)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的过程。

5mC 最初被发现位于 CpG 岛内，CpG 岛是富含CpG二核苷酸的基因启动子区域常见的一段DNA片段。CpG岛是一个富含CpG位点的区域，通常定义为：一个长度至少为200bp的片段，其GC含量高于60%，主要位于基因的启动子区（70%的基因）。DNA甲基化主要发生在CpG位点。在哺乳动物中，70%到80%的CpG位点的胞嘧啶是甲基化的。

目标区域甲基化重测序（Hi-MethylSeq），又叫重亚硫酸盐扩增子测序（Bisulfite Amplicon Sequencing，BSAS）。在前期全基因组甲基化测序、全基因组甲基化芯片等工作基础上，或者依据文献报道目的基因甲基化与性状/疾病关联，选择感兴趣的目的区间或候选基因，利用Hi-MethylSeq技术对大规模群体的候选基因甲基化水平进行检测。

Hi-MethylSeq技术通过亚硫酸氢盐（bisulfite）处理，用多重PCR扩增目的片段，添加barcode和测序通用接头，在Illumina X10二代测序平台对PCR产物进行高通量测序，利用生物信息学方法，精确定量计算目标区间内的甲基化位点的甲基化状态，在完成目标区域检测的同时大幅降低研究费用。

第二部分：方法技术

靶向甲基化重测序

翼和策略：目标区间甲基化重测序（Hi-MethylSeq）

优势：Hi-Methylseq结合了亚硫酸盐转换、靶向扩增子高通量测序技术，可实现多区段、多位点的甲基化精确定量分析。

第三部分：应用方向

1、 适用于感兴趣的目的片段的甲基化研究 ；

2、适用于在大样本中进一步确认全基因组甲基化研究挑选的阳性位点。

文献：1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160