双色荧光TaqMan探针法：为什么比SYBR Green法更可靠？

在qPCR检测中，常用的检测方法有两种：SYBR Green法和TaqMan探针法。翼和生物的端粒酶催化亚基TERT基因表达检测试剂盒采用的是双色荧光TaqMan探针法，这其中有什么讲究？为什么说TaqMan探针法比SYBR Green法更可靠？

SYBR Green法：经济但特异性不足SYBR Green是一种能与双链DNA结合的荧光染料。当它与双链DNA结合时，荧光强度会显著增强。在qPCR反应中，随着扩增产物的增加，SYBR Green结合的双链DNA越来越多，荧光信号也越来越强。

SYBR Green法的优点是成本低、使用方便，不需要设计特异性探针。但它的缺点也很明显：特异性不足。因为SYBR Green能与所有双链DNA结合，包括非特异性扩增产物和引物二聚体，所以容易产生假阳性信号，结果的准确性和重复性都不够理想。

在检测低丰度基因（如TERT）时，SYBR Green法的这个缺点尤为突出，因为非特异性扩增的干扰会更加明显。

TaqMan探针法：特异且灵敏TaqMan探针法使用的是特异性的荧光探针。探针是一段与靶序列互补的寡核苷酸，两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团。当探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，检测不到荧光。在PCR扩增过程中，Taq酶的5→3外切酶活性会将探针切断，报告基团和淬灭基团分离，从而发出荧光。

TaqMan探针法的优势非常明显：

• 特异性高：探针只能与特异性靶序列结合，只有靶序列被扩增时才会产生荧光信号，大大减少了非特异性扩增的干扰。

• 灵敏度高：探针法的背景荧光低，能检测到更微量的靶序列。

• 重复性好：结果稳定，CV值低。

• 可多重检测：通过不同荧光标记的探针，可以在单管中同时检测多个靶基因。

翼和生物的双色荧光技术翼和生物的端粒酶检测试剂盒采用双色荧光TaqMan探针法，FAM通道检测TERT基因，Cy5通道检测内参基因GAPDH。单管反应即可同时检测目的基因和内参基因，既节省了样本和试剂，又保证了两个基因检测条件的一致性，使定量结果更准确。

此外，翼和生物还创新性地采用了两套检测系统信号增强技术。针对TERT基因设计了两对定量引物和同一种荧光标记的探针，混合后进行多重定量，显著提高了整个体系的灵敏度和TERT荧光信号量，ΔRn增强了3倍。这对于检测低丰度的TERT基因来说尤为重要。

相比市场上其他采用SYBR Green法的同类产品（如江苏凯基的试剂盒），翼和生物的TaqMan探针法在结果的准确性、稳定性和灵敏度上都更好，是科研工作者的可靠选择。