多重qPCR中的无中生有：荧光通道间的交叉干扰

以往的qPCR检测多为单重检测，随着检测技术的发展，多重qPCR因能显著提升效率（省时省力）而于临床检测中越发受到关注。然而，多重qPCR实验也会面临一些技术挑战，其中之一便是“漏光"现象——即荧光通道间的交叉干扰。了解并克服它是获取可靠结果的关键。

一、问题的发现：并非扩增的“扩增曲线"

在一次实验中（算法：相对荧光值法-log），我们进行了三重体系的扩增检测。奇特的是，虽然只在体系中加入了FAM通道的模板，HEX通道却也出现了明显的扩增曲线。这显然不符合预期。检查原始曲线后确认，HEX通道实际上并无真实的扩增信号。

扩增曲线图（相对荧光值法-log）：

原始曲线图：

二、问题的来源：算法与物理特性的双重影响

经过分析与多方咨询，问题主要来自于两方面：

1.算法影响：扩增曲线算法选择了“相对荧光值法-log"，此算法的优点在于能更清晰地显示出微弱的扩增信号（尤其适用于多重实验中信号强度变化差异大的情况，此时若是选择与原始曲线差异不大的绝Abs olute对 Quantification荧光值法便可能会误导结果判读）。

扩增曲线-绝Abs olute 对Quantification荧光值法：

可以看到绝Abs olute对 Quantification荧光值法下的扩增曲线HEX很平坦，但仍与阈值线有交叉。

2.物理特性：荧光染料的发射光谱并非特点典型的单峰，而是具有一定宽度的“波包"。这导致相邻通道（如FAM & HEX/VIC, CY5 & ROX）间存在一定程度的光谱重叠，从而产生信号干扰（通常低于1%，但也存在仪器间差异，建议定期校准仪器）。

下面用这次实验中的FAM和HEX通道的原始曲线荧光强度做个展示。

FAM通道原始曲线13循环处荧光：

FAM通道原始曲线35循环处荧光：

HEX通道原始曲线13循环处荧光：

HEX通道原始曲线35循环处荧光：

本次实验中HEX受到FAM“漏光"的程度：（46.69-20.62）/（4635.65-2580.53）=0.0127。

三、问题的优化策略

荧光光谱重叠是物理本质，虽难以消除，但可通过策略尽可能减少干扰影响：

1.结合实验设计忽略无模板通道：

在已知特定通道无目标模板的多重检测（如同系列实验或固定试剂盒方案）中，明确忽略该通道结果即可。

2.原始曲线辅助判读是关键：

无论算法如何处理，原始曲线代表了仪器探测到的原始荧光信号。当扩增曲线形态异常（如本例或基线设置不当导致时），回归原始曲线是判断真伪扩增的关键。

3.仪器定期校准：

按照仪器制造商的要求进行定期校准，好的设备是保障实验正常开展的基础。

4.巧妙避免算法影响：

相对荧光值算法利用了除法放大信号变化，这样一来若是本底信号本身够强（比如预载相应探针），便能有效覆盖交叉干扰带来的本底变化，使得在相对荧光值法下，该通道也能保持明显的非扩增状态。

下面是来自上海翼和SPF级大小鼠国标病原体检测系列试剂盒的“国标必检病毒联检"项目的阳性对照PC3，该阳性对照无ROX通道模板，但由于联检试剂盒ROX通道有对应探针，本底信号覆盖了干扰。

翼和国标必检病毒联检PC3扩增曲线（相对荧光值法-log）：

翼和国标必检病毒联检PC3原始曲线：