支原体qPCR阴性对照扩增曲线翘尾的原因

标准扩增曲线：呈S型，分为基线期、指数起始期、指数扩增期和平台期，且要求拐点清楚，整体平行性好，基线平而无上扬现象。

阴性对照扩增曲线翘尾：是指ct值在35之后（判读临界点）出现扩增。

小编根据自己的经验总结如下原因：

1、环境污染：如实验室经常稀释阳性样本或出现高浓度阳性样本，会污染环境造成气溶胶污染。

解决方案：（1）建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。

（2）使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照，并使用带滤芯的枪头进行加样，加样顺序是：阴性对照，待测样本，阳性对照。

（3）阳性样本分区操作，设置专门的阳性操作区。

2、无菌操作不到位：环境中存在大量支原体，如人口腔中存在口腔支原体、土壤中存在发酵支原体。如果无菌操作不规范，都会引入污染。

解决方案：（1）进入无菌室操作前，佩戴一次性袖套，穿专用工作服、一次性帽子及鞋套、口罩。工作服、帽及鞋套、口罩，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

（2）从枪头盒中取出枪头时，尖部不能触及外露部位及离心管和管架边。

（3）操作中，不能在样品上方翻转瓶盖，袖口不能掠过样品上方。

（4）换下的专用实验服，进行紫外线，一次性鞋套额帽子扔进垃圾桶。

（5）无菌室和缓冲间定期大扫除，保持整洁。

（6）每周用核酸清除剂清洁无菌操作台、传递窗和桌面，实验垃圾建议当场封闭并丢弃。

（7）实验前用1% 84消毒液擦净台面及四周，放好需用的实验器材及各种溶液，并用酒精棉球擦拭，更换干净的管架。

3、试剂耗材污染：阳性移液枪未专用，直接加样，易引起污染；枪头、离心管、PCR管等耗材，不是无菌或暴露在阳性环境中，也易引入污染。

解决方案：（1）使用专用阳性移液枪加阳性样本，同时设置阳性区。

（2）使用无菌耗材，耗材用完后封口，避免暴露在环境中。

（3）实验室设立分区，可分为配液间（洁净区）、样本处理区、阳性区和核酸扩增区；不同分区的耗材和移液器勿交叉使用。

4、试剂盒在配制过程中污染：如果操作不当，环境和耗材也会引入污染。

解决方案：可以通过试剂盒入库前质控检测。

5、非特异性扩增：试剂盒冻融次数过多，导致引物探针断裂。

解决方案：试剂避免反复多次冻融，可分装储存。