支原体(Mycoplasma)：目前发现的最小原核生物，据统计约15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能，易致实验结果不稳定，须对培养细胞定期进行支原体检测。

本试剂盒采用双色荧光 qPCR (TaqMan 探针法) 检测支原体DNA。检测对象为细胞培养的上清液，细胞沉淀或其他生物制品。该试剂盒具有以下特点：

灵敏：配合推荐使用的核酸抽提方案，检测灵敏度达到10CFU/ml。

       可靠：抽提加入内标核酸，全过程质量控制。

       稳定：全程闭管操作，无交叉污染。

       方便：操作简单，无需电泳步骤。

表1   产品组分

注：

1、阳性质控含有支原体DNA和内标DNA。

2、内部质控含有内标DNA。

在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意事项和无菌操作规范！

【操作步骤】

1.样本制备

    （1）样本的标准制备方案：请配合使用高效无微生物污染的DNA抽提试剂盒提取样本DNA。整个过程需要遵守无菌操作规范。本公司目前推荐抽提试剂盒见附录3。直接取20 µL待测样本DNA，作为模板进行 qPCR 反应。

     （2）前处理阴性样本准备方案：将RNase Free Water当成样本，加入内部质控，进行核酸抽提。

2. qPCR 反应液的准备

       （1）根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做3个重复孔。

     反应孔数=1个阳性PCR质控+1个阴性PCR质控+1个前处理阴性质控+样本数× 3

      （2）根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量（需有1孔的加样损失量）：

     Mix =（反应孔数+1）×10 μl

      （3）各试剂放室温融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：

表2  qPCR Mix的配制

3. 加样

      （1）震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。

      （2）向每孔反应管中分装 10 μL qPCR Mix。

      （3）向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 ul石蜡油。

      （4）向反应管中加入样品后短暂离心，加样示例如下：

      表 3 加样示例

【注】：此时每个反应孔的体积为30μL。

       qPCR 阴性的PCR模板为20 ul RNase Free Water。

PCR 仪设置以 ABI 7500 为例，相对定量模式，选择TaqMan 探针法：

注：1、该程序为两阶段扩增法，如荧光定量PCR仪可以两阶段收集荧光，按照正常Ct值判断结果；如果只能最后一步收集荧光，需要在原数据的基础上加15个Ct值。

   2、ROX设置是以7500为例，但也存在例外，例如StepOne。

【阈值设置】

  以ABI 7500 为例，扩增曲线选择 log 法，如果不能两阶段收集荧光，基线设置1~2个循环；如果可以，基线设置3-15个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。

（1） 内参(HEX/VIC)阈值设定：以阳性对照定内参扩增曲线阈值，将内参的Ct 值定为 28±2。

 （2）支原体(FAM)阈值设定：以阳性对照定支原体扩增曲线阈值，将支原体(FAM)的 Ct 值定为 28±2 。

【实验质量控制】

如果阳性对照管的支原体(FAM)Ct 值>30，但阳性对照管及前处理阴性对照管的内参(HEX)Ct 值正常，表明阳性支原体对照模板有降解。

如果样品前处理阴性的内参（HEX/VIC)Ct 值>30，阳性对照管的内参(HEX)Ct 值>30 ，表明内参DNA存在降解或PCR体系扩增效率下降。

   【结果判读】

根据支原体(FAM) Ct 值、内标(VIC) Ct 值判定，具体标准如下：

要求每个检测样品做3重复，如果3复孔中，两重复为阳性，则判读为阳性；建议做样本前处理阴性，可以质控整个抽提过程。

注：检测结果异常时：

1. 样品前处理阴性：内参Ct值过大，表明抽提效率低；支原体检测通道Ct值小于37.5，可能前处理抽提过程存在污染。

2. qPCR阴性：支原体和内参检测通道Ct值小于37.5，操作过程存在污染。

3. 样本前处理阴性质控和PCR阳性质控内参差1±1个Ct值属于正常现象。

  【PCR过程注意事项】

由于 PCR 反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生DNA 污染：

  1．试剂盒开启后，阳性质控和内部质控与试剂Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蜡油分开存放。

   2．每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。

  3．要求核酸抽提和qPCR过程都符合无菌操作规范。

  4．建议自备转运盒，用于将配制分装好的Mix从配置Mix超净工作台转运到加样超净工作台。

  5．建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。

  6．建议 qPCR 配置与分装在一个无菌操作台，样本的加样在另外一个无菌操作台。

  7．建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照，并使用带滤芯的枪头进行加样。

  8．应按照先加阴性，再加样本，最后加阳性的顺序加样。且阳性用专门的加样器。建议阳性在专门的无菌操作台加样。

  9．qPCR 反应板封膜或盖盖子时须反复压紧。

 10．上机扩增前，反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底

 11．盖上反应管盖子或者贴上光学膜后，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。

 12．本产品仅作科研用途。